Implementarea rapidă a proiectelor de citometrie în flux cu ajutorul modulelor de achiziție a datelor de înaltă precizie

Citometria în flux este utilizată pe scară largă de către clinicieni și diagnosticieni pentru a analiza caracteristicile celulelor. Celulă cu celulă, aceștia evaluează optic nivelurile de proteine, sănătatea sângelui, granularitatea și dimensiunea celulelor, printre alte atribute. Deși sunt sisteme extrem de sensibile, proiectanții de citometre sunt supuși unei presiuni constante de a accelera timpul de analiză, ceea ce necesită noi abordări atât pentru citometria în flux, cât și pentru componentele electronice asociate.

Citometrele supun celulele individuale la lumina laser pentru a crea semnale împrăștiate și de fluorescență. Pentru a capta rapid și precis lumina rezultată și pentru a o converti în semnale digitale este nevoie de o fotodiodă cu avalanșă (APD) și de componente electronice complexe. Proiectarea și implementarea circuitelor pentru acest proces pot dura mult timp, în special având în vedere că sistemele de achiziție a datelor de citometrie în flux necesită dispozitive de mare viteză și cu zgomot redus pentru a asigura acuratețea sistemului.

Pentru a susține în mod rentabil o analiză mai rapidă a citometriei în flux, proiectanții pot rezolva problemele de viteză și precizie cu o soluție de achiziție de date care cuprinde drivere de amplificatoare interne și un convertor analogic-digital (ADC).

Acest articol va arăta pe scurt cum funcționează sistemele de citometrie în flux. În continuare, se prezintă ADAQ23878 de la Analog Devices, un modul ADC pe 18 biți, și se arată cum poate fi utilizat pentru a proiecta un etaj de detecție și conversie pentru citometrul în flux. De asemenea, va fi introdus și un kit de evaluare asociat.

Principiile citometriei moderne în flux

Citometria în flux modernă este un proces automatizat care analizează moleculele celulare și de suprafață, și care caracterizează și definește diferite tipuri de celule într-o populație celulară eterogenă. Fără a lua în considerare timpul de pregătire, care ar putea dura mai mult de o oră, instrumentul realizează o evaluare a trei până la șase caracteristici ale 10.000 de celule individuale în mai puțin de un minut.

Pentru a permite acest lucru, etapa de pregătire a celulelor unice prin citometrie în flux este esențială. Organizarea eșantioanelor are loc în mod hidrodinamic într-un lichid de înveliș, pentru a concentra celulele sau particulele într-un flux de eșantion îngust, cu o singură linie de celule, pentru analiză. Cu această transformare, celulele unice trebuie să își păstreze caracteristicile biologice și componentele biochimice naturale.

Figura 1 prezintă o diagramă a unui instrument pentru citometrie în flux care începe în partea de sus cu eșantionul de celule multiple.

Figura 1: diagrama unui citometru în flux, de la focalizarea învelișului până la achiziția datelor. (Sursa imaginii: Wikipedia, modificată de Bonnie Baker)

Cele șase componente principale ale citometrului în flux sunt o celulă de flux, un laser, o fotodiodă cu avalanșă (APD), un amplificator de transimpedanță (TIA), un ADC și un computer pentru colectarea și analiza datelor.

Citometrul în flux are un flux de lichid sau un fluid de înveliș, care este îngustat pentru a transporta și alinia celulele într-un singur rând prin fasciculul de lumină. Lumina laserului captează câte o celulă pe rând, creând un semnal de lumină împrăștiată înainte (FSC) și un semnal de lumină împrăștiată lateral (SSC). Lumina fluorescentă este ajustată cu ajutorul oglinzilor și filtrelor și apoi amplificată de un APD.

Următorul pas este detectarea, digitizarea și analiza luminii rezultate după ce aceasta atinge APD-ul. Pentru detecție, amplificatorul operațional de intrare FET de 500 megahertzi (MHz) LTC6268 de la Analog Devices, cu curent de polarizare foarte mic și zgomot de tensiune redus, este ideal pentru TIA de mare viteză necesară pentru detecție.

Figura 2: circuitul TIA utilizează un APD (PD₁) și un amplificator operațional FET cu curent de intrare redus pentru a converti curenții foarte mici ai fotodiodei într-o tensiune de ieșire la IN1+. (Sursă imagine: Bonnie Baker)

Este esențial ca acest circuit amplificator să se proiecteze cu cea mai largă lățime de bandă posibilă, astfel încât capacitățile parazite trebuie să fie reduse la minimum. De exemplu, capacitatea parazită de reacție, C, influențează stabilitatea circuitului din Figura 2 și lățimea de bandă. Indiferent de alegerea pachetului de rezistoare, va exista întotdeauna o capacitate parazită în calea de reacție a amplificatorului. Cu toate acestea, un pachet 0805, care are o distanță mai mare între capacele de capăt și cea mai mică capacitate parazită, este de preferat pentru aplicațiile de mare viteză.

Creșterea distanței dintre capetele R₁ nu este singura modalitate de a reduce capacitatea. O altă modalitate de a reduce capacitatea de la placă la placă este de a proteja căile de câmp E care generează capacitatea parazită prin plasarea unui traseu suplimentar de masă sub rezistența R₁ (Figura 3).

Figura 3: adăugarea unui traseu de masă sub rezistorul de reacție îndepărtează câmpul E de pe partea de reacție și îl duce spre masă. (Sursă imagine: Analog Devices)

În acest caz, metoda implică în mod specific amplasarea unui scurt traseu de masă sub și între plăcuțele rezistorului din apropierea capătului de ieșire al TIA. Această tehnică produce o valoare a capacității parazite de 0,028 picofarazi (pF) cu o lățime de bandă TIA de 1/(2π*R_F*C_PARASITIC), egală cu 11,4 MHz.

Semnalele luminoase optice sunt orientate spre mai multe diode cu avalanșă cu filtre optice corespunzătoare. APD, TIA și sistemul ADC convertesc aceste semnale în reprezentarea lor digitală și trimit datele la microprocesor pentru analiză ulterioară.

De obicei, instrumentele moderne au mai multe lasere și APD-uri. Dispozitivele comerciale actuale au zece lasere și treizeci de fotodiode cu avalanșă. Creșterea numărului de lasere și de detectoare fotomultiplicatoare permite etichetarea multiplă a anticorpilor pentru identificarea cu precizie a populațiilor țintă prin markeri fenotipici.

Cu toate acestea, viteza de analiză depinde de un echilibru fin între:

• Viteza învelișului cu fluid
• Capacitatea procesului de focalizare hidrodinamică de a forma linii de celule unice
• Diametrul tunelului
• Capacitatea de a păstra integritatea unei celule
• Componentele electronice

Concentrarea acustică prin citometrie în flux

În timp ce adăugarea mai multor lasere și APD-uri accelerează analiza și identificarea, în cel mai bun caz, cele mai recente metode moderne de citometrie în flux cu o singură celulă pot colecta date despre până la un milion de celule individuale pe minut. În multe aplicații, cum ar fi detectarea celulelor tumorale circulante prezente în sânge la niveluri de până la 100 de celule pe mililitru, acest lucru este inadecvat. În aplicațiile clinice pentru celulele rare, testele necesită în mod regulat analiza a miliarde de celule, ceea ce necesită mult timp.

Alternativa la procesul de pregătire a celulelor cu focalizare hidrodinamică este un proces de focalizare acustică. În acest caz, un material piezoelectric, cum ar fi titanatul de zirconat de plumb (PZT), este atașat la un sistem capilar de sticlă pentru a converti impulsurile electrice în vibrații mecanice (Figura 4a). Prin utilizarea unui PZT pentru a determina vibrarea pereților laterali ai unui sistem capilar de sticlă la frecvența de rezonanță a celulei de curgere dreptunghiulare, sistemul generează o varietate de unde staționare acustice cu un număr variabil de noduri de presiune.

Figura 4: o ilustrare a unei celule de curgere acustică realizată cu un sistem capilar de sticlă dreptunghiular (a). Amplasarea primelor trei noduri de presiune pentru un sistem capilar cu lățime fixă (b). (Sursa imaginii: National Center for Biotechnology Information)

Aceste noduri de frecvență PZT aliniază în mai multe linii discrete particulele care curg (Figura 4b). Celula de curgere acustică utilizează o undă acustică liniară, staționară, pentru a se acorda la diferite lungimi de undă prin crearea de armonici unice sau multiple. După cum prevede modelul simplu de undă staționară liniară, celulele din eșantion produc linii unicelulare individuale sau multiple în camera de curgere.

Cu această organizare precisă a celulelor, lățimea tunelului învelișului de curgere se poate lărgi pentru a permite viteze mai mari de curgere pe lângă fasciculul laser (Figura 5).

Figura 5: cu fluxul de probă hidrodinamic (c. și d.), pe măsură ce lățimea învelișului crește, probele de celule se împrăștie, ceea ce îngreunează procesul de măsurare optică. Fluxurile de probe focalizate acustic (a. și b.) mențin celulele pe un singur rând, indiferent de lățimea învelișului. (Sursa imaginii: Thermo Fischer Scientific)

Focalizarea hidrodinamică tradițională (Figura 5c.) aranjează liniile de celule unice în vederea pregătirii pentru scanarea cu laser. În timp ce o pâlnie mai largă pentru miezul fluxului de probă permite o viteză mai mare a materialului de înveliș (Figura 5d.), aceasta duce, de asemenea, și la împrăștierea organizării unicelulare, producând o variație a semnalului și compromiterea calității datelor.

Focalizarea acustică (Figura 5a.) aliniază strâns celulele biologice și alte particule, chiar și cu un tunel mai larg. Această aliniere precisă a celulelor permite rate de eșantionare mai mari, menținând în același timp calitatea datelor (Figura 5b.).

În practică, focalizarea acustică a citometriei în flux crește frecvența de eșantionare a celulelor de aproximativ 20 de ori (Figura 6).

Figura 6: comparație a timpului de eșantionare pentru diferite echipamente de citometrie în flux bazate pe citometria în flux cu sistem fluidic (A, B, C) față de citometria cu focalizare acustică (D). (Sursa imaginii: Thermo Fischer Scientific)

În Figura 6, echipamentele din A, B și C utilizează tehnologia hidrodinamică, în timp ce D utilizează abordarea fluxului de citometrie cu focalizare acustică.

Achiziția datelor de citometrie în flux cu focalizare acustică

Proiectarea electronicii pentru echipamentele de citometrie în flux cu focalizare acustică necesită o electronică de fotodetecție de mare viteză pentru a se adapta la viteza celulelor sanguine și a fluidului de înveliș prin duza cu diametru mai mare. LTC6268 de mare viteză, de 600 MHz, menționat anterior, în combinație cu o dispunere specializată a pachetului de rezistoare 0805, crește rata de detecție optică până la 11,4 MHz (Figura 7, stânga). Ieșirea din LTC6268 este transmisă la un ADC ADAQ23878 de la Analog Devices pentru digitizare.

Figura 7: ADC-ul ADAQ23878 digitalizează semnalul optic de la fotodiodă (PD₁) și de la circuitul TIA (stânga). (Sursa imaginii: Bonnie Baker)

ADAQ23878 este o soluție de achiziție de date SIP (System-in-Package) de mare viteză, de precizie, pe 18 biți, cu 15 mega eșantioane pe secundă (MSPS). Acesta reduce considerabil ciclul de dezvoltare a sistemelor de măsurare de precizie, prin transferul sarcinii de proiectare a selecției, optimizării și dispunerii componentelor driverului de intrare de la proiectant la dispozitiv.

Abordarea modulară a SIP reduce numărul de componente ale sistemului final prin combinarea mai multor blocuri comune de procesare și condiționare a semnalelor într-un singur dispozitiv, împreună cu un ADC de mare viteză, pe 18 biți, cu registru de aproximare succesivă (SAR) de 15 MSPS. Aceste blocuri includ un amplificator de comandă ADC cu zgomot redus, complet diferențial, și un tampon de referință stabil.

ADAQ23878 încorporează și componentele pasive critice care utilizează tehnologia iPassive de la Analog Devices pentru a minimiza sursele de eroare dependente de temperatură și pentru a optimiza performanța. Etajul de comandă cu stabilizare rapidă al ADC-ului contribuie la capacitatea acestuia de a asigura o achiziție rapidă a datelor.

Evaluarea modulului ADAQ23878 µModule

Pentru a evalua ADAQ23878, Analog Devices oferă placa de evaluare EVAL-ADAQ23878FMCZ (Figura 8). Placa demonstrează performanța modulului ADAQ23878 μModule și este un instrument versatil pentru evaluarea unui proiect de front-end pentru citometrie în flux și a multor alte aplicații.

Figura 8: placa de evaluare EVAL-ADAQ23878FMCZ pentru ADAQ23878 are circuite de alimentare integrate, este prevăzută cu software asociat pentru controlul și analiza datelor și este compatibilă cu SDP-H1. (Sursă imagine: Analog Devices)

Placa de evaluare EVAL-ADAQ23878FMCZ necesită un computer personal cu Windows 10 sau o versiune mai recentă, o sursă de semnal de precizie cu zgomot redus și un filtru trece-bandă adecvat pentru testarea pe 18 biți. Placa de evaluare are nevoie de plugin-ul ADAQ23878 ACE și de driverul SPD-H1.

Concluzie

Examinarea unei celule biologice la un moment dat cu ajutorul tehnicilor standard de citometrie în flux cu focalizare hidrodinamică este una de succes, dar, având în vedere necesitatea unei analize mai rapide, s-a observat o trecere la tehnici bazate pe metode de flux cu focalizare acustică. Cu toate acestea, componentele electronice care susțin o citometrie în flux mai avansată trebuie, de asemenea, să se îmbunătățească, minimizând în același timp spațiul, costurile și timpul de dezvoltare.

După cum s-a arătat, amplificatorul operațional de mare viteză LTC6268 și soluția de achiziție de date de precizie, de mare viteză, μModule ADAQ233878, pot fi combinate pentru a crea un sistem complet de achiziție de date pentru echipamentele avansate de citometrie în flux.